کیت تست ضد تیروئید پراکسیداز الایزا کیت تست آنتی بادی ضد TPO

کیت Elisa Anti-TPO Anti-Thyroid Peroxidase

1. استفاده مورد نظر

ایمونواسی برای تعیین کمی در شرایط آزمایشگاهی آنتی بادی های پراکسیداز تیروئید در سرم انسانیتعیین anti-TPO به عنوان کمکی در تشخیص بیماری های خود ایمنی تیروئید استفاده می شود.

2. خلاصه 

• پراکسیداز اختصاصی تیروئید (TPO) روی میکروزوم های تیروسیت وجود دارد و در سطح سلول آپیکال آن بیان می شود.این آنزیم در همکاری با تیروگلوبولین (Tg) یک عملکرد اساسی در ید زایی L-تیروزین و جفت شدن شیمیایی مونو- و دی-یدوتیروزین حاصل برای تشکیل هورمون های تیروئید T4، T3 و fT3 دارد.
• TPO یک اتوآنتی ژن بالقوه است.تیترهای سرمی بالا از آنتی بادی های TPO در آن یافت می شود انواع مختلفی از تیروئیدیت ناشی از خودایمنی.اصطلاح "آنتی بادی میکروزومی" که هنوز هم اغلب یافت می شود از زمانی سرچشمه می گیرد که TPO هنوز به عنوان یک آنتی ژن در خودایمنی ناشی از میکروزوم ها شناسایی نشده بود.در مفهوم بالینی، دو اصطلاح anti-TPO و آنتی بادی میکروزومی را می توان مترادف استفاده کرد.با این حال، با توجه به روش های آزمایش تفاوت هایی وجود دارد.
• تیتر ضد TPO بالا در 90 درصد از بیماران مبتلا به تیروئیدیت مزمن هاشیموتو یافت می شود.در بیماری گریوز 70 درصد بیماران تیتر بالایی دارند.اگرچه حساسیت این روش را می توان با تعیین همزمان سایر آنتی بادی های تیروئید (ضد Tg، آنتی بادی گیرنده TSH - TRAb) افزایش داد، یک یافته منفی احتمال بیماری خودایمنی را رد نمی کند.میزان تیتر آنتی بادی با فعالیت بالینی بیماری ارتباطی ندارد.در ابتدا تیترهای افزایش یافته می تواند پس از دوره های طولانی بیماری یا در طول بهبودی منفی شود.اگر پس از بهبودی آنتی بادی ها دوباره ظاهر شوند، احتمال عود وجود دارد.
• در حالی که آزمایش‌های معمول آنتی‌بادی میکروزومی از میکروزوم‌های خالص‌نشده به‌عنوان آماده‌سازی آنتی‌ژن استفاده می‌کنند، آزمایش‌های ضد TPO از یک پراکسیداز خالص‌شده استفاده می‌کنند.این دو روش از نظر حساسیت بالینی عملکرد قابل مقایسه ای دارند، اما به دلیل کیفیت بالاتر آنتی ژن مورد استفاده، می توان از تست های anti-TPO سازگاری لات به لات بهتر و ویژگی بالینی بالاتر انتظار داشت.سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم از آنتی ژن انسانی و خرگوش آنتی بادی ضد IgG انسان (ضد IgG).

3. اصل تست

روش غیر مستقیم، مدت زمان کل سنجش: 70 دقیقه.

ELISA Anti-TPO از روش الایزای غیرمستقیم و فاز جامد برای تشخیص آنتی بادی های TPO در روش انکوباسیون دو مرحله ای استفاده می کند.نوارهای میکرو چاه پلی استایرن از قبل با آنتی ژن های TPO انسانی با واکنش ایمنی بالا پوشیده شده اند.در مرحله اول انکوباسیون، آنتی بادی های اختصاصی ضد TPO، در صورت وجود، به آنتی ژن های TPO از پیش پوشش داده شده فاز جامد متصل می شوند.چاهک ها شسته می شوند تا پروتئین های سرم متصل نشده حذف شوند، و آنتی بادی های ضد IgG خرگوش (anti-IgG) کونژوگه شده با آنزیم ترب کوهی پراکسیداز (HRP- Conjugate) اضافه می شود.در طی مرحله دوم جوجه کشی، این آنتی بادی های کونژوگه با HRP به هر کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی (IgG) که قبلاً تشکیل شده بود متصل می شوند و سپس با شستشوی HRP-کونژوگه غیرمجاز حذف می شود.محلول های کروموژن حاوی تترمتیل بنزیدین (TMB) و پراکسید اوره به چاهک ها اضافه می شوند و در حضور کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی-ضد IgG (HRP)، کروموژن های بی رنگ توسط ترکیب HRP متصل به یک محصول آبی رنگ هیدرولیز می شوند.رنگ آبی پس از توقف واکنش با اسید سولفوریک زرد می شود.

میزان شدت رنگ را می توان اندازه گیری کرد و به ترتیب با مقدار آنتی بادی جذب شده در چاهک ها و با مقدار آنتی بادی در نمونه متناسب است.

4. مواد معرف ارائه شده است

• میکروپلیت روکش دار، نوار 8*12، 96 چاه.از قبل با آنتی ژن TPO انسانی پوشیده شده است.

• کالیبراتورها، 6 ویال، هر کدام 1 میلی لیتر، آماده استفاده.غلظت ها: 0 (A)، 25 (B)، 50 (C)، 100 (D)، 250 (E) و 500 (F) IU/mL.

• کنژوگه آنزیمی، 1 ویال، 11.0 میلی لیتر HRP (پراکسیداز ترب) نشاندار شده با آنتی بادی های ضد IgG خرگوش (ضد IgG) در بافر Tris-NaCl حاوی BSA (آلبومین سرم گاوی).حاوی 0.1% نگهدارنده ProClin300.

• رقیق کننده سرم: 1 ویال، 11 میلی لیتر.حاوی نمک های بافر و رنگ

• محلول شستشو کنسانتره، 1 ویال، 25 میلی لیتر (40X غلیظ)، محلول شستشو PBS-Tween.

• سوبسترا، 1 ویال، 11 میلی لیتر، آماده مصرف، (tetramethylbenzidine) TMB.

• محلول توقف، 1 ویال، 6.0 میلی لیتر اسید سولفوریک 1 mol/l.

• IFU، 1 کپی.

• درب بشقاب: 2 عدد.

مواد مورد نیاز (اما ارائه نشده)

• میکروپلیت ریدر با قابلیت جذب طول موج 450 نانومتر و 620 نانومتر.

• واشر میکروپلیت.

• ماشین جوجه کشی.

• بشقاب شیکر.

• میکروپیپت ها و میکروپیپت های چند کاناله که 50 میکرولیتر را با دقت بهتر از 1.5 درصد تحویل می دهند.

• کاغذ جاذب.

• آب مقطر

5. روش تست

• فقط از تعداد چاه های مورد نیاز استفاده کنید و چاه های میکروپلیت را برای هر کالیبراتور و نمونه مورد سنجش فرمت کنید.

• 100 میکرولیتر کالیبراتور را به هر چاهک اضافه کنید.

• 100 میکرولیتر رقیق کننده نمونه (رنگ سبز) به هر چاهک به جز چاهک کالیبراتور اضافه کنید.

• 10 میکرولیتر نمونه را به هر چاه رقیق کننده نمونه اضافه کنید (توجه: معرف ها در چاهک ها از سبز به رنگ آبی در می آیند)، سپس 30 ثانیه تکان دهید.

• روی صفحه را با درب بشقاب بپوشانید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.

• محتویات میکرو پلیت را با تخلیه یا آسپیراسیون دور بریزید.در صورت تخلیه، ضربه بزنید و صفحه را با کاغذ جاذب خشک کنید.

• 350 میکرولیتر محلول شستشو اضافه کنید، آن را تخلیه کنید (با ضربه بزنید و لکه بزنید) یا آسپیره کنید.4 بار دیگر برای مجموع 5 شستشو تکرار کنید.در پایان شستشو، صفحه را برعکس کنید و محلول شستشوی باقیمانده را روی کاغذ جاذب بمالید.

• 100 میکرولیتر کونژوگه آنزیمی اضافه کنید،

• روی صفحه را با درب بشقاب بپوشانید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.

• 350 میکرولیتر محلول شستشو اضافه کنید، آن را تخلیه کنید (با ضربه زدن و لکه) یا آسپیره کنید.4 بار دیگر برای مجموع 5 شستشو تکرار کنید.در پایان شستشو، صفحه را برعکس کنید و محلول شستشوی باقیمانده را روی کاغذ جاذب بمالید.

• 100 میکرولیتر بستر را به هر چاهک اضافه کنید.روی آن را بپوشانید و در دمای محیط (25-18 درجه سانتیگراد) در تاریکی به مدت 10 دقیقه انکوبه کنید.پس از افزودن بستر، صفحه را تکان ندهید.

• به هر چاهک 50 میکرولیتر محلول توقف اضافه کنید.

• به مدت 15-20 ثانیه تکان دهید تا مایع درون چاهک مخلوط شود.مهم است که اطمینان حاصل شود که رنگ آبی به طور کامل به زرد تغییر می کند.

• جذب هر چاهک را در 450 نانومتر (با استفاده از 620 تا 630 نانومتر به عنوان طول موج مرجع برای به حداقل رساندن عیوب چاه) در صفحه خوان میکرو بخوانید.نتایج باید ظرف 30 دقیقه پس از افزودن محلول توقف خوانده شود.